原标题：生物等效性试验方案中伦理审查和项目执行所关注的问题及案例分析
生物等效性(BE)试验是评价仿制药与原研药质量和疗效一致性的关键研究。BE临床试验的数据需提供给国家药品监督管理局(NMPA)进行审查，以此作为决定该药上市与否的重要依据。临床试验方案设计的优劣直接关系到试验能否达到预期目标、试验结果是否准确可信、结论是否可靠，直接影响BE临床试验的成败。科学、详尽、清晰的临床试验方案，应该包括试验药物简介、试验目的、入选和排除标准、药物的用法用量、受试者选择、样本量估算、数据管理和统计方法等相关方面的内容。本文对近年来伦理委员会在审查BE临床试验方案和Ⅰ期病房在临床试验方案操作过程中需关注的问题进行探讨，分析需要注意的几点，明确解决办法，为BE临床试验的规范运行提供依据，保证临床试验方案设计的科学性、临床试验的质量，切实保护受试者权益。
©千库网
1 试验设计不合理
1.1 清洗期设置不合理
案例1：某药人体BE研究，该药清除半衰期约为128~149h，试验方案设计清洗期为3周。
生物等效性试验一般都会采用交叉试验设计。在采用交叉设计的研究中，为避免药物的残留效应，试验设计要保证有足够的清洗期以确保每个周期开始时药物浓度接近于零或可忽略。
2016年《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》规定清洗期应不少于药物的7个半衰期，欧洲药品管理局(EMA)规定不少于5个半衰期［1］。上述研究，以恩替卡韦最长清除半衰期149h计算，清洗期至少应设计31d，方案中清洗期设计为3周，无法保证第1周期服用的药物在体内清除完全。部分研究，如检测物含有主要代谢物，清洗期的设计还需要考虑到代谢产物的半衰期。以替格瑞洛为例，根据替格瑞洛(商品名：倍林达)的说明书显示，口服替格瑞洛后，替格瑞洛及其主要代谢物AR-C124910XX的终末消除半衰期分别约为7和9h。以两者中半衰期较长的AR-C124910XX的半衰期计算清洗期，清洗期超过63h基本能够保证第1周期的研究药物在人体内基本全部清除，可以消除两制剂的互相干扰，避免第1周期内的处理对第2周期的影响。如果研究药物为复合制剂，清洗期的设置则要考虑各个药物成分的半衰期。诸如此类问题需要在方案讨论时认真讨论，避免清洗期设置不合理的情况。伦理审查时对清洗期的设置也会特别关注，应引起足够的重视。
1.2 采血点设计不合理
案例2：某药人体BE研究，Tmax约为6h，该药及其主要活性代谢产物药物-葡萄糖苷酸结合物在健康受试者体内的消除半衰期约为22h，采血点设计为0h(给药前60min内)和给药后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0，36.0，48.0 和72.0h共18个时间点，预实验结果显示10例中有2例在给药后0.5h即达到Cmax。
采样点的确定对药代动力学研究结果具有重大的影响。根据《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》2005年版要求［2］，一个完整的血药浓度-时间曲线，应包括药物各时相的采血点，即采样点应包括给药后的吸收相，峰浓度附近和消除相。一般在吸收相至少需要2~3个采血点，峰浓度附近至少需要3个采血点，消除相至少需要3~5个采血点，一般不少于11~12个采血点。根据《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》2016年版［1］，建议每个周期采样12~18个采血点。采样持续时间应有3~5个消除半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。除可用AUC0-72h 来代替AUC0-t 或AUC0-∞的长半衰期药物外，AUC0-t 至少应覆盖AUC0-∞的80%。该药正式试验根据以上法律和法规及上述预试验结果，增加给药后10，20min采血点，去掉3.5h采血点，吸收相至少取2~3个点(10，20min和0.5，1.0，1.5h)，峰浓度附近至少3个点(2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0h)，消除相至少取3~5个点(10.0，12.0，24.0，36.0，48.0，72.0h)，共19个时间点，采血持续了5个以上半衰期，能够完全满足吸收相、峰浓度附近和消除相的采血点要求。
2 试验对象选择不合理
BE临床试验通常为非治疗目的，根据EMA和美国食品药品监督管理局(FDA)的建议，优先选择健康志愿者作为受试者进行BE试验，但出于安全性原因，也可选择患者作为试验对象。受试者作为研究的主体，样本选择上应具有代表性，明确纳入标准、排除标准、剔除标准，以确保研究对象的同质性。只有符合入选标准且不符合排除标准的受试者方可入组。入排标准应尽量明确，避免入选本不应该进入研究的患者，也要避免过于严格的标准造成受试者入组困难或失访。
2.1 入选标准过于严格或不明确
入选标准作为能够入组的基本条件，除满足诊断要求，还需考虑受试者年龄、性别、种族等因素。由于中西方人群的差异，因此在设置入选标准时应充分考虑国内的人群特点。
2.1.1 对身高体重规定过于严格
案例3：某BE研究，入选标准规定“健康男性及女性受试者，体重＞50kg，19kg · m- 2 ≤体重指数(BMI)≤26kg · m- 2 ”。
该研究规定受试者体重需大于50kg，在国内，部分女性虽可满足BMI的要求，但是由于身高较矮，无法满足体重要求；满足体重要求的女性，BMI在正常偏大范围内，引起入选偏移。在不影响研究质量的前提下，可将入选标准修改为“男性体重不低于50.0kg(含)，女性体重不低于45.0kg(含)”，纳入体重及BMI达标的健康女性。
2.1.2 对健康状况和避孕情况的控制
入选标准还需对受试者健康状况、避孕情况等作出要求：
① 对受试者健康状况的要求，如无重要既往病史，体格检查、实验室检查等经研究医师判断为合格或异常无临床意义者；实验室检查异常值的判定以各病种的指导原则作为参考。
② 对避孕的要求，如受试者从试验筛选至研究药物最后1次给药后一段时间无生育计划且能采取有效避孕措施。为避免因受精卵着床较晚出现妊娠试验假阴性而入组的情况，建议女性受试者从试验筛选前2周即开始采取有效的避孕措施。
2.1.3 对受试者充分知情的控制
受试者试验前均需签署知情同意书、并对试验内容、过程及可能出现的药物不良反应充分了解，并能够按照试验方案要求完成试验。为保证受试者充分知情，本中心在知情同意书的签署页设置了问卷，由受试者自主进行判断，如受试者完全知晓，才可以进行后续的筛选。
2.2 排除标准不明确
排除标准应基于安全性方面的考虑，排除可能会对试验的开展、试验结果造成影响的受试者人群。食物药物过敏、吸烟及酗酒、重大疾病、药物滥用、妊娠等均需包含在排除标准中。但在方案设计过程中，如果不是十分明确，会给伦理审查和方案执行带来歧义。
2.2.1 疾病史规定过于笼统
案例4：某BE研究，排除标准包含“健康状况：有神经系统、精神系统、呼吸系统、心血管系统、消化道系统、淋巴系统、内分泌系统、骨骼肌系统疾病和代谢异常等病史及有重要脏器疾病史者。”
排除标准是在符合入选标准基础上排除其他不满足试验要求的情况，是入选标准的补充。排除标准过于笼统，可操作性差。上述研究提到的具有的“神经系统、精神系统、呼吸系统、心血管系统、消化道系统、淋巴系统、内分泌系统、骨骼肌系统疾病和代谢异常等病史”的受试者需要排除，由于排除标准中未规定既往疾病的严重程度，部分研究者认为凡是有上述系统疾病史，即便是既往患有肺炎、阑尾炎等可治愈疾病史的受试者均需要排除，部分研究者认为只有有严重疾病史的受试者才需要排除。研究者对排除条件理解的不同，会造成本不应该入选的患者进入临床试验。
2.2.2 影响药物吸收和代谢的因素应细化
如有其他急性或慢性疾病，或有吞咽困难者应排除。如试验药物经肝药酶代谢，受试者服药前应注意避免食用对CYP450酶有抑制或诱导作用的食材，因此在服用试验药物前48h内摄取了影响代谢酶的食物也需排除。为避免药物相互作用，如受试者在服用试验药物前14d内服用了任何药物需排除。此条款应尽可能列明对试验药物代谢有影响的药物和食物的名称，伦理审查委员和研究者也会认为不明确大部分具体药物或食物，可操作性不强。
2.2.3 对“3个月内参加过临床试验”的理解
为保护受试者安全，部分试验把“3个月内参加过任何临床试验者”作为排除标准，但是在执行过程中，部分受试者仅参与筛选，最终没有入组的，不应包含在此范围内，因此，在筛选前3个月内服用了其他临床试验药物或仍处于其他临床试验药物的半衰期的6倍时间内者需排除，建议把此排除标准改为“3个月内服用任何试验药物者”。
©千库网
3 高脂餐的设置不合理
案例5：某喹诺酮药物BE试验，西餐餐谱中有牛奶，中餐餐谱中有豆制品或菠菜。
该药物说明书及文献报道表明，含钙、镁、铝或铁的药物或膳食补充剂会降低该药的治疗效果，口服喹诺酮类药物前后2h内又服用含有多价阳离子(钙、铝、镁、铁、锌)的食物，喹诺酮类药物的最大血清浓度能够大大减少25%~90%［3-4］。牛奶和豆制品中均含钙离子，菠菜中含铁离子，虽然饮食中的离子含量较低，但是为了尽最大可能避免阳离子的干扰，在设置餐谱时，应尽可能的避免含上述阳离子的食物。
其他对饮食有特殊要求，不能遵守统一饮食者应予以排除，如对标准食物不能耐受者或不能耐受高脂餐，特别是高脂餐中含有奶制品而受试者对乳糖不耐受或/和有罕见的遗传性半乳糖不耐受、Lapp乳糖酶缺乏或葡萄糖-半乳糖吸收不良者等。同时饮食方面还需考虑到受试者的宗教信仰对饮食的特殊要求。
每个试验可根据试验药物的特点按需增加其他排除标准，例如药物有肝肾毒性，则可设置部分实验室检查值排除范围，如肌酸酐清除率(CrCl)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)等。此外，研究者判断不适合参加该试验的受试者也需要排除。
4 样本量估算不准确
案例6：试验方案中缺少样本量的计算，仅根据《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》中关于受试者例数的要求：“对于目前的统计方法，18~24例可满足大多数药物生物等效性试验样本量的要求”。BE试验纳入24例健康受试者。
BE试验评价中样本量的估算是一个很复杂的问题，也是方案设计中的一个重要环节。科学、合理地对样本量进行估算，不但可以避免由于样本量过少引起的假阴性结果，还能有效减少人力、物力、财力和时间的浪费，达到预期研究结果［5］。根据国家药品监督管理局发布的《生物等效性研究的统计学指导原则》(2018年第103号)，交叉设计的样本量需考虑以下几个因素：
① 检验水准α。α值即第Ⅰ类错误出现的概率(假阳性概率)，α值越小则样本量越大，反之越小，通常取双侧0.1(双单侧0.05)；
② 检验效能又叫把握度(power of test)，为1-β。β为第Ⅱ类错误出现的概率(假阴性率)，一般取β=0.10或0.20，通常至少为80%；
③ 个体内变异系数(CVw%)，可通过国内外文献报道或预试验结果进行估计；
④ 几何均值比(GMR)；
⑤ 等效性界值。
平行组设计的样本量估计可参考一般连续型变量的样本量计算公式。样本量除了满足统计学要求外，还要符合法规要求。在一项BE试验中，可评价的受试者数目不应少于18例［6］。
估算的样本量通常是研究的最低需要量，还要考虑受试者中途脱落、失访、退出试验事件等情况的发生，因此，试验进行时还需要适当增加10%~20%的样本量。高变异药物BE研究，在相同的样本量估计参数设置下，4周期交叉设计所需的样本量低于3周期交叉设计［7］。以利伐沙班为例，试验设计采用4周期、单剂量、完全重复交叉，以药代动力学参数(AUC，Cmax)为主要分析指标，假定单侧α=0.05，β=0.1，Intra-CV=21%，假设受试药物与参比药物生物等效的把握度为0. 90，受试药物和参比药物几何均值比值(T/R)0.9，生物等效区间为80.00%~125.00%，用PASS(version14.0.7)软件计算，2×2试验样本量为55例，4×2试验样本量为28例。综合考虑受试者的脱落风险，空腹/餐后试验至少入组30例受试者。伦理委员会在审查方案时也会首先查看样本量是否是通过统计学估算的，否则一般会修改后重审，因此，样本量估算必须引起足够的重视。
5 方案的规范性问题需要格外的注意
案例7：某方案在某机构伦理委员会审查时发现方案中出现别的Ⅰ期临床研究中心的名字，方案摘要的部分数据与正文不一致，采血量计算不准确，排版出现低级失误(上下标没有标注正确，文中出现乱码，语句不通顺，直译国外文献，标点符号不合适等)。
在伦理委员会委员看来，一个临床试验方案的完整、规范是代表研究者和申办方对临床试验的重视程度，因此，务必不要仓促递交伦理，在制定方案的时候务必认真核对，注意逻辑性，尽力要求各方组织方案讨论会议进行细致讨论，以防止不能顺利通过伦理审查延误排期。
6 讨论
BE试验是新药研发过程中评价药品质量、安全性和有效性的重要手段。试验方案的设计既要达到安全性评价要求，也要满足有效性评价的需要。这就要求研究人员不但具备药学专业相关知识和统计学相关知识，还需熟知各项法律和法规。只有关注试验设计的各个环节，不断完善细节，才能提高临床研究质量，为评价药物的疗效和安全性提供依据，同时也能获得时间上的优势，起到事半功倍的效果。
参考文献
［1］国家药品监督管理局. 以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则［EB/OL］. 北京: 国家药品监督管理局，2016-03-18［2019-05-22］. http:///WS04/CL2093/229256.html.
［2］国家药品监督管理局. 化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则［EB/OL］. 北京: 国家药品监督管理局，2005-03-18［2019-05-22］. http:///WS04/CL2196/323492.html.
［3］刘英. 食物对口服抗菌药物疗效的影响［J］. 临床合理用药，2012，5(6B) : 87.
［4］NEUVonEN P J，KIVIST K T，LEHTO P. Interference of dairy products with the absorption of ciprofloxacin［J］. Clin Pharmacol Ther，1991，50(5Pt 1) : 498-502.
［5］孙华，梁大虎，谢海棠. 两阶段生物等效性研究的试验设计及关注要点［J］. 药物评价研究，2017，40(5) : 593-599.
［6］国家药品监督管理局. 生物等效性研究的统计学指导原则［EB/OL］. 北京: 国家药品监督管理局，2018-10-17［2019-05-22］.http:///WS04/CL2182/331454.html.
［7］刘甜甜，陆梦洁，周憧憧，等. 高变异药物生物等效性评价确切样本量计算［J］. 中国临床药理学杂志，2017，33 (12) : 1152-1157.
http:///WS04/CL2138/338047.htm.
［4］WHO. questions and answers simalr biotherapeutic products［EB/OL］. Geneva: WHO. 2017-12-12［2019-06-25］. https://www.who.int/biologicals/QA_for_SBPs_HK_12_Dec_2017_(2).pdf?ua=1.
［5］EMA．Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: non-clinical and clinical issues［EB/OL］．London: EMA.2015-01-09［2019-06-25］．https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-similar-biological-medicinal-products-containing-biotechnology-derived-proteins-active_en-2.pdf．
［6］FDA. FDA Presentations for the July 13，2016 Meeting of the Arthritis Advisory Committee［EB /OL］. Silver Spring: FDA. 2016-07-26［2019-06-25］. https://www.fda.gov/media/98951/download.
［7］FDA. Labeling for Biosimilar Products［EB/OL］. Silver Spring: FDA. 2018-07-18［2019-06-25］．https://www.fda.gov/media/96894/download.
［8］HITEN J. GUTKA，HARRY YANG，SHEFALI KAKAR． Biosimilars-Regulatory，Clinical，and Biopharmaceutical Development［M］．Cham: Sringer，2018: 9.
［9］FDA. BIOSIMILARS ACTION PLAN: Balancing Innovation and Competition［EB/OL］．Silver Spring: FDA. 2018-07-18［2019-06-25］．https://www.fda.gov/media/114574/download．
［10］HITEN J．GUTKA，HARRY YANG，SHEFALI KAKAR． Cham: Sringer，Biosimilars Regulatory，Clinical，and Biopharmaceutical Development［M］．2018: 10-15．
作者：王晨静，柳艳平，时萍，李欣，李婷，马雅萍，高晓萌，曹玉(青岛大学附属医院)
选自：中国临床药理学杂志 2019年9月 第35卷 第18期 2161-2164
责任编辑：
